воскресенье, 26 июля 2009 г.

Перевод статьи, медицина

Особенности стрептококковой деоксирибонуклеазы (стрептодорназы*)

Дж. Л. ПОТТЕР И М. ЛАСКОВСКИ

Кафедра биохимии, Университет Маркетта, медицинский факультет, Милуоки, Висконсин

(подано на публикацию 15 декабря, 1958)

Было бы гораздо проще объяснить нуклеотидную последовательность в цепях дезоксирибонуклеиновой кислоты если бы количество ферментов, способных к гидролизу полинуклеотидной цепи в особых местах было известно и доступно. В ходе поисков таких ферментов мы обратили внимание на стрептодорназу. Фермент получают из культур Стрептококка и он доступен в достаточно чистом виде чтобы гарантировать возможность исследования его особенностей.

ЭКСПЕРИМЕНТЫ И ИХ РЕЗУЛЬТАТЫ

Стрептодорназа была получена доктором Б.Л. Хатчингсом (лаборатория Ледерле ), которому мы выражаем искреннюю благодарность. Согласно Кэю и др. (2) ДНК была получена из вилочковой железы теленка.

Продукты ферментной биологической переработки были проанализированы с помощью колоночной хроматографии, в основном по методу Синсгеймера (3), но с описанными выше модификациями (4). Бумажная хроматография проводилась по методам Хотчкиса (5), Мархама и Смита (6) и Бергквиста (7). Бумажный ионофорез проводился по методам Мархама и Смита (6).

К тому же, в исследовании использовались следующие ферменты: кристаллическая панкреатическая ДНКаза I (приобретенная у Уордингтон Биокемикал корпорейшн); простатическая фосфатаза,1 приготовленная по методу Бомана (8) с учетом описанных выше модификаций (9); фосфодиэстераза змеиного яда, приготовленная по недавно модифицированному методу,2 с использованием фракционирования ацетона по методу Кернера и Синсгеймера (10), фракционирования с использованием этанола при уровне pH 6.0, а также хроматографии сперва на карбоксиметилцеллюлозе (II), затем на ДЕАЕ-целлюлозе (12, 13). Контаминация 5'- нуклеотидазой в этих препарата была ниже уровня обнаружения.

Стрептококковая ДНКаза изучалась с целью установления оптимальных условий, необходимых для активности. Рис. 1 иллюстрирует влияние pH на активность, измеренную спектрофотометрически с помощью увеличения гашения на 260 . На рис. 2 показано влияние концентрации Mg++ на активность. Подобные явления активации наблюдались и с другими двухвалентными катионами: Mn++, Sr++, Ca++, Zn++, Co. ++ Полное ингибирование фермента наблюдалось в среде с содержанием 0,001 m версена (динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты).

* Тщательно очищенный препарат стрептококковой дезоксирибонуклеазы, компонент of варидазы стрептокиназы-стрептодорназы (Ледерле).

При поддержке гранта Nos. E-28 и B-57A от Американского Общества по Борьбе с Раком и гранта No. AT (11-1)293 от Комиссии по атомной энергии. Предварительный доклад был опубликован (1).

Адрес на данный момент: институт патологии, Университет Западного резервного района, медицинский факультет, Кливленд, Огайо.

1 Мы в долгу перед доктором Л. Каннингемом за этот препарат.

2 Не было опубликовано.

Спектрофотометрический метод также применялся для приблизительной оценки объема биологической переработки. Образцы ДНК были основательно обработаны ДНКазой I и стрептококковой ДНКазой соответственно. Затем было проведено сравнение роста оптической плотности. В случае с ДНКазой I количество разорванных межнуклеотидных связей было около 25 процентов (14). Предположим, что оптический эффект пропорционален количеству разорванных связей. Тогда соответствующая оценка биологической переработки стрептококковой ДНКазы составила бы около 18 процентов гидролизированных межнуклеотидных связей. Так как эта оценка приблизительна (15), дальнейшие эксперименты косвенно свидетельствуют о правильности приведенной выше оценки.

ДНК вилочковой железы теленка (320 мг) была обработана стрептококковой ДНКазой, обработка была хроматографирована на столбце Dowex 1-X2(Рис. 3). Здесь практически не наблюдаются мононуклеотиды (первый пик на столбце представляет собой неизбежную контаминацию смолой), и следы наличия динуклеотидов. Большая часть гидролизата могла бы быть элюирована только из формата аммония 0,75 m или выше, с учетом того, что фрагменты относятся к последовательности три- и декануклеотидов.

Количества мононуклеотидов (около 0,1 процента) было недостаточно для характеристики. Для того чтобы определить, исчезают ли фрагменты в 3'- или 5'-фосфате, применялась следующая процедура. "Фракция 0,75 m ," в которой преобладают тринуклеотиды, была выбрана в качестве субстрата. Если бы фрагменты исчезали в 5'-фосфате, биологическая обработка фосфодиэстеразой привела бы исключительно к смеси мононуклеотидов: pXpYpZ -> pX + pY + pZ. Если бы фрагменты исчезали в 3'-фосфате, биологическая обработка привела бы к 1/3 нуклеозидов, 1/3 нуклеотидов и 1/3 нуклеозиддифосфатов: XpYpZp ^ X + pY -f- pZp. Результаты обработки " Фракции 0,75 m," фосфодиэстеразой проиллюстрированы на Рис. 4. Присутствуют только следы наличия нуклеозидов (наличествующих во время лиофилизации фракции); нуклеозиддифосфаты отсутствуют, в то время как все четыре мононуклеотида присутствуют и составляют 96 процентов фракции 0,75 м. Таким образом, приходим к выводу, что продукты исчезают в 5'-фосфате, будучи задействоваными в биологическую переработку ДНК панкреатической ДНКазой I.

Принимая во внимание это заключение, необходимо выяснить гидролизируются ли одни и те же межнуклеотидные связи ДНКазой I и стрептококковой ДНКазой, или нет. Результаты эксперимента, в котором целый, нефракционированный гидролизат ДНК одним из ферментов, был подвержен воздействию второго фермента, показаны на Рис. 5. Только в последовательности, в которой за стрептококковой ДНКазой следует ДНКаза I есть доказательство существенного дальнейшего гидролиза. Это можно интерпретировать как то, что ДНКаза I, кроме расщепления тех же связей, что и стрептококковая ДНКаза,





Concerning the Specificity of Streptococcal Deoxyribomiclease (Streptodornase*) t

J. L. POTTEEf AND M. LASKOWSKI

From the Department of Biochemistry, Marquette University School of Medicine, Milwaukee, Wisconsin

(Received for publication, December 15, 1958)

The elucidation of nucleotide sequences in chains of deoxy-ribonucleic acid would be greatly facilitated if a number of en­zymes, capable of hydrolysing the polynucleotide chain at specific locations, were known and available. In the course of a search for such enzymes our attention fell upon strep todornase. The enzyme is derived from cultures of Streptococcus and is now avail­able in a state sufficiently pure to warrant the investigation of its specificity.

EXPERIMENTAL AND KESUXTS

Streptodornase was obtained through the courtesy of Dr. B. L, Hutchings (Lederle Laboratories), to whom we express our grati­tude. DNA was prepared from calf thymus according to Kay et d. (2).

The products of enzymatic digestion were analyzed with col­umn chromatography essentially according to Sinsheimer (3) but modified as previously described (4). Paper ehromatog-raphy involved the methods of Hotchkisa (5), Markham and Smith (6) and Bergkvist (7). Paper ionophoresis was carried out according to Markham and Smith (6).

In addition, the following enzymes have been used in this study: crystalline pancreatic DNaae I (purchased from Worthing -ton Biochemical Corporation); prostatic phosphatase,1 prepared according to Boman (8) with previously described modification (9); and snake venom phosphodiesterase prepared by a recently modified method,2 which involves acetone fractionatioa accord­ing to Koerner and Sinsheimer (10), fractionation with ethanol at pH 6.0, and chromatography first on CM-celluIose (II), then on DEAE^celluiose (12, 13), The contamination by 5'-nucleo-tidase in these preparations was below the level of detection.

Streptoeoccal DNase was studied in order to establish optimal conditions for activity. Fig. 1 illustrates the influence of pH on activity measured spectrophotometrically by the increase in extinction at 260 m/i. Fig. 2 shows the effect of Mg++ concen­tration on activity. Similar activating effects were observed with other divalent cations: Mn-n-, Sr++, Ca++, Zn++, Co++. Complete inhibition of the enzyme was observed in a medium containing 0.001 m Versene (ethylenediaminetetraacetate).

* A highly purified preparation of streptococcal deoxyribonu-clease, a component of Varidase Streptokinase-Streptodornase {Lederle).

t Supported by Grant Nos. E-28 and B-57A from the American Cancer Society and Grant No. AT (11-1)293 from the Atomic En­ergy Commission. A preliminary report has been published (1).

t Present address, Institute of Pathology, Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, Ohio.

1 We are indebted to Dr. L. Cunningham for this preparation.

2 Unpublished.

The speetrophotometric method has also been used for an approximate estimation of the extent of digestion. Samples of DNA were exhaustively digested with DNase I and streptococcal DNase, respectively, and the increases in optical density were compared. In the case of DNase I the number of internucleotide bonds broken is established as about 25 per cent (14). On the assumption that the optical effect is proportional to the num­ber of linkages broken, the corresponding value for streptococcal DNase digestion would be about 18 per cent of internucleotide bonds hydrolyzed. Wheras this is only an approximation (15), further experiments provide indirect evidence in support of the above value.

Calf thymus DNA (320 mg.) was digested with streptococcal DNase, and the digest was chromatographed on Dowex 1-X2 column (Fig. 3). There are practically no mononucleotides (the first peak from the column represents an unavoidable con­tamination from resin), and only traces of dinueleotides. The greater part of the digest could be eluted only with 0.75 m or higher ammonium formate, suggesting that the fragments are of the order of tri- to decanueleotides.

The amount of mononucleotides (about O.I per cent) was too small for characterization. In order to establish whether the fragments are terminated in 3'- or S'-phosphate, the Mowing procedure was used. The "0.75 m fraction," which is composed predominantly of trinucleotides, was chosen as a substrate. Should the fragments be terminated in 5'-phosphate, the diges­tion with phosphodiesterase will lead exclusively to a mixture of mononucleotides: pXpYpZ -> pX + pY + pZ. Should frag­ments be terminated in 3'-phosphate, digestion will lead to J nucleosides, J nucleotides, and j nucleoside diphosphates: XpYpZp ^ X + pY -f- pZp. The results of the digestion of "0.75 m fraction," with phosphodiesterase are illustrated in Fig. 4. There is only a trace of nucleosides (occurring during lyo-philization of the fraction); nucleoside diphosphates are absent, whereas all four mononucleotides are present and account for 96 per cent of the 0.75 M fraction. It is concluded therefore that the products are terminated in 5'-phosphate, as they are in the digest of DNA by pancreatic DNase I.

In view of this finding it appeared desirable to investigate whether the same internucleotide linkages are hydrolyzed by DNase I and streptococcal DNase. The results of the experi­ment in which a total, nonfractionated digest of DNA by one of the enzymes was subjected to the action of the second enzyme are shown in Pig. 5. Only in the sequence in which streptocoecal DNase was followed by DNase I was there evidence of substantial further digestion. The results could be interpreted to mean that DNase I, beside cleaving the same bonds as streptococcal DNase,

Комментариев нет:

Отправить комментарий